COVER Single frame from a super-resolution movie of α-actinin (magenta) bundling actin cytoskeletal filaments (green) into thick fibers at the edges of growing membrane ruffles in a living COS-7 cell. The movie was acquired with a new form of nonlinear structured illumination microscopy that achieves 62-nanometer resolution at subsecond acquisition times for dozens of frames. See page 944 and dx.doi.org/10.1126/science.aab3500.
Image: Dong Li and Eric Betzig, Janelia Research Campus/Howard Hughes Medical Institute

新的光学显微镜技术树立活细胞超分辨率成像新标准

来自美国霍华德休斯医学研究所，Janelia研究园的科学家们，借助其发展的新光学超分辨率成像技术，在前所未有的高分辨率条件下研究了活体细胞内的动态生物过程。他们的新方法显著的提高了结构光照明显微镜(structured illumination microscopy, SIM)的分辨率，一种最适合活体超分辨成像的技术。

新技术所拍摄的视频生动地展现了细胞内蛋白质的运动和相互作用。它们帮助生物学家理解细胞是怎样改变它们之间的依存结构，以及重整细胞膜结构使得细胞外的分子可以被吸收到细胞内。来自Janelia研究园的研究员Eric Betzig博士，李栋博士后*和他们的同事们基于原有的SIM显微镜原理新发展了两种新的超分辨率成像技术。超分辨率光学显微成像技术能够跨越理论的分辨率极限，在极高的分辨率下展现细胞内的精细结构。但是，到目前为止，超分辨率显微镜技术却依然不能进行有效的活体细胞成像。

“这些方法设立了超分辨率光学显微镜的成像速度和非侵入特性的新标准，它们使得超分辨率活体细胞成像成为现实。”Betzig博士说道。这一研究成果将于2015年8月28日在美国《科学》杂志上发表。

在传统的SIM显微镜中，物镜下的物体被非均匀的结构光（类似于条纹码）所照明。在实验中，几束不同的结构光用来照明物体，它们和物体在不同角度混频所产生的摩尔条纹被相机依次采集。然后计算机提取摩尔条纹编码的信息并将其解码生成三维的高分辨率图像。最终重建的SIM图像具有高于传统显微镜图像2倍的空间分辨率。

Betzig博士和其他两位科学家因为发展超分辨率荧光显微镜而被授予2014年诺贝尔化学奖。他说道，SIM显微镜技术之所以没有得到像其它方法那样多的关注，是因为其它技术能够提供比两倍更高的分辨率改进效果。但是，他强调SIM拥有两大其它的超分辨率方法所没有的优势。这些其它方法包括了两种去年获得诺贝尔奖表彰的技术：他和同事Harald Hess博士于2006年开发的光激活定位显微镜（photoactivated localization microscopy, PALM），和受激辐射耗尽（stimulated emission depletion， STED）显微镜。但是，这两种技术都需要过多或过强的光来照明样品，以至于荧光蛋白很快被漂白，细胞样品很快被损害，从而不可能长时间进行成像。然而，SIM在这些方面不一样，“我爱上了SIM，因为它的速度很快，而且它所需的照明光强度远远小于其它方法。”Betzig博士说道。

Betzig博士在2011年Mats Gustafsson博士去世后不久开始与SIM相关的研究。Gustafsson博士是SIM技术的先驱之一，生前也是Janelia的研究员。Betzig博士那时已经深信SIM有潜力为解析细胞内部的工作机理提供重要的见解，如果SIM的空间分辨率可以被提高， 它对于生物研究的可用性将被大大增强。

在生前，Gustafsson博士和博士生Hesper Rego发展了一种利用饱和耗尽（saturated depletion）的非线性SIM技术，但这种技术在改进分辨率的同时需要使用很多的光照并且散失了SIM成像速度快的优势。Betzig博士想到了一种可以避免这些缺陷的方法。

饱和耗尽非线性SIM利用光可反复开关的荧光蛋白和其在开关过程中的饱和耗尽效应来提高分辨率。它产生图像的过程是，首先把所有的荧光蛋白分子激活到可发光的状态（亮态），然后用一束结构光把大部份的亮态分子反激活到暗态。通过结构光反激活之后，仅有少数处于结构光最弱区域的分子仍然保持在亮态。这些光调控过程提供了物体的高空间频率信息，从而让图像更加清晰。这一过程需要重复25或更多次才能产生最终的高分辨率图像。Betzig博士说道，这一原理非常类似于STED或另一种与其相关的叫做RESOLFT的超分辨率技术的原理。

这一技术并不适合于活体成像，因为激活和反激活荧光蛋白需要很长的时间。另外，反复的光照明会对细胞和荧光蛋白本身造成损伤。Betzig博士说道，“这一技术的问题在于你首先用光激活了所有的荧光蛋白分子，然后你马上又用另一束光反激活了大部份分子。这些被反激活的分子对最终的图像没有任何贡献，但却被你用光“油炸”了两次。你让分子承受了很大“压力”，并且花了很多你并没有的时间，因为这段时间内细胞在运动。”

解决方法其实很简单，Betzig博士说道：“没有必要激活所有的分子。”在Betzig研究小组新发展的结构光激活非线性SIM的技术中，一开始用结构光只激活样品里的一部分荧光蛋白分子。“这一结构光激活过程已经给你一些高分辨率的信息了。”Betzig博士解释道。另外一束结构光用于反激活分子，额外的信息可以在反激活的过程中同时被读出。两个结构光叠加的效应给与最终图像62纳米的分辨率，这一结果好于原始的SIM，并且把由光波长决定的传统分辨率极限改进了三倍。

“我们能够做到快速地超高分辨率成像。”Betzig博士说道。这很重要，他补充道，因为对于动态过程，单纯提高空间分辨率而没有相应地提高成像速度是没有意义的。“如果细胞内部有的结构以1微米每秒的速度运动，并且我有1微米的分辨率，那么我需要在一秒内采集图像。但如果我有1/10微米的分辨率，那么我就必需在1/10秒内采集图像，不然图像将变得模糊。”Betzig博士解释道。

结构光激活非线性SIM可在1/3秒内采集25幅原始图像，并从中重建出一幅高分辨率图像。它的图像采集很高效，只需用较低的照明光强，并且收集每一个亮态荧光蛋白分子所携带的信息。从而有效地保护了荧光分子，使得显微镜能够进行更长时间的成像，让科学家们可以观测到更多的动态活动。

Betzig博士的团队利用结构光激活非线性SIM获得了在细胞运动和改变形状的过程中骨架蛋白的解体和自身再组装过程，以及在细胞膜表面的叫做caveolae的微小内吞体动态过程的影像。

在Science论文里，Betzig博士的团队也利用了已经商业化的高数值孔径物镜将传统SIM的空间分辨率提高到84纳米。高数值孔径限制了被光照明的样品范围，从而降低了光对细胞以及荧光蛋白分子的损伤。这一方法可以同时对多个颜色通道进行成像，使得科学家们可以同时跟踪几种不同蛋白质的活动。

通过高数值孔径的方法，Betzig博士的团队观测了多个骨架蛋白质在形成粘着斑（链接细胞内外的物理链）过程中的运动和相互作用。他们也追踪了clathrin修饰的内吞体的成长和内吞过程（内吞体将细胞外的分子转移到细胞内）。他们的定量分析回答了几个不能被以往的成像技术所解决的问题，例如，内吞体的分布，以及内吞体尺寸和寿命之间的关系。 最后，通过结合高数值孔径方法和结构光激活非线性SIM，Betzig博士和他的同事可以在超高分辨率条件同时追踪两种蛋白质的活动。

Betzig博士的团队在进一步提高他们的SIM技术。他们也急切地盼望和生物学家一起探索潜在的应用并进一步改进这一技术的可用性。

现在，科学家们可以通过Janelia的高级成像中心利用这些新的SIM技术，这个中心提供免费使用前沿的显微镜技术的机会。最后，Betzig博士说道，使得SIM成为能够被其他实验室获得并能够承担的技术应该是比较直接的事。“大部份的‘魔术’在于软件而不是硬件。”

* 李栋博士后将于2016年在中国科学院生物物理所成立他的独立研究小组。

显微技术的改善揭示了对细胞过程的新理解

研究人员显著提高了活细胞结构照明显微术（SIM）的分辨率，SIM是与其它超分辨技术相比有许多好处的一类显微术。其结果已经给人们就细胞过程提供了一个更为详细的了解，且对健康研究具有重要的意义。目前，许多其它类型的超分辨显微镜都有缺陷；例如定位显微术和受激发射损耗显微术必须使用高强度的光照和荧光标记才能获取图像，而这会对活体细胞造成损害，即使是在短时间之后。SIM所用的照明强度水平要低得多，但到目前为止，它的分辨率一直限于衍射上限的两倍。为了提高SIM的分辨率，Dong Li 等人用了一种较高数值孔径（NA）的透镜。较高的NA不仅将SIM的分辨率从100纳米提高至84纳米，而且将激发限制在细胞容量的一小部分，从而进一步降低了光毒性并消除了失焦的背景。在第二种方法中，该小组用处于某种波长的照明条纹来激活一个荧光蛋白亚组，并接着用处于第二种波长的条纹模式来诱导这些蛋白发射荧光。这两种照明模式的结合可给出62纳米的分辨率，这一分辨率比仅用一种模式所得到的分辨率要好得多。研究人员接着用这些改善的分辨技术来获取对细胞过程的新的了解。例如，研究界就肌动蛋白在网格蛋白介导的细胞内吞中所起的作用存在着某些争论，但通过SIM分辨率的改善，Li等人能够确认，肌动蛋白的存在增加了网格蛋白内化的概率。他们的研究还用这些新的分辨度对其它数种细胞过程进行了探索，并为蛋白互动提供了漂亮的图像和卓越的细节。这篇文章还伴有一套多媒体资料，包括对诺贝尔得主Eric Betzig和文章主要作者Dong Li的采访，他们对其工作及其应用进行了解释。

生活史或能解释鸣禽悖论

热带鸣禽为什么比温带鸣禽所生的后代少是一个长期存在的问题，对这一问题的解释可能与受到纬度分隔的这两类鸣禽的生活史有关。为了给这种现象寻找一种合理的解释，Thomas Martin对在美国、马来西亚和委瑞内拉的鸣禽雏鸟的生长速度做了分析。他指出，热带鸣禽会更快地长成更长的翅膀，这一优势可能对帮助这些鸣禽躲避被掠食是有用的。因此，即使热带与温带鸣禽是在大约相同的时间生长羽毛的，但热带鸣禽却有更好的飞行优势。Martin进一步提出，在温带鸣禽中因为资源较少（尤其是温带鸣禽的生活史，因为它们往往会有更高的成年时的死亡率）而没有见到其有类似的翅膀生长情况。热带成年鸣禽死亡率较低可能意味着它们会有较少的后代，但它们却能给其后代投入更多的资源，为其后代提供更好的生存机会。另一方面，温带鸣禽为了生存的希望而需要生更多的但“品质”较低的后代。

文字说明: 北温带鸣禽（如这只隐士鸫）常常会养育4只或更多的雏鸟，而热带鸣禽则通常只会养育2只幼鸟。

资料来源: Thomas E. Martin

非理性交配选择可改进性伴侣选择理论

在试图选择配偶时，雌性会选择两个雄性中的更“有吸引力”的那个是毫不奇怪的——然而，一项新的研究揭示，雌性泡蟾容易受到“诱饵”效应的影响，即当有第三个较差的选项介入时，雌性泡蟾会在头2个雄性选项中挑选吸引力较差的那个。本研究的这些结果与目前在性选择理论中所用的理性选择模型相悖。为了检测蛙类交配选择中这种效应发生的情况，Amanda Lea 和 Mike Ryan 用80只雌性泡蟾来做实验，这些泡蟾已知会被雄性低频和持续时间长的叫声所吸引。他们接着确认了3种不同的叫声变异，并对雌性对其中每一个叫声变异的偏爱程度进行了检测。尽管叫声B与叫声A相比是更受欢迎的选择，但雌性泡蟾会在出现作为诱饵的泡蟾时明显更容易选择处在中间的目标A。注意到这种效应与该诱饵叫声是在某特定地点或是在一个难辨识的地点被觉察到无关。作者们提出，在诸如这种复杂的社会性处境中，理性选择会耗费时间，并因而可能导致失去交配的机会或带来将自己进一步暴露于掠食动物的风险。这一研究的结果凸显了在配偶选择时环境的影响力会有多大，它们与我们了解性对象选择时的显著意义有关。需要做进一步的研究以更好地理解“诱饵”效应在适合性最大化中的作用。

文字说明: 雄性呼叫泡蟾的照片。雄性泡蟾在发出宣告性呼叫时其声囊会显著膨胀。

资料来源: Amanda M. Lea